Das Herzstück der Sammlungen bilden die ursprünglichen Bestände, die Joseph II. für die Gründung der Institution anschaffen ließ, allen voran die weltberühmte Sammlung anatomischer Wachsmodelle. Des Weiteren zählen zu den Beständen, medizinische Instrumente und Modelle, Bilder, Archivalien, Nachlässe, Lehrmittel, die aus den unterschiedlichen Tätigkeiten der Fakultät in Wissenschaft, Lehre, Forschung und Gesundheitswesen erwachsen sind und somit deren Entwicklung in vielfältiger Weise repräsentieren.

Das Josephinum beherbergt das kulturelle Erbe der Wiener Medizinischen Schule, deren Weltgeltung 1938 abrupt endete. Sie leistete einen maßgeblichen Beitrag zur Entwicklung der modernen Medizin. Einen großen Teil der Bestände machen Bilder (Fotografien, Druckgrafiken, Zeichnungen, Gemälde etc.) aus, die mit Einzel- und Gruppenportraits aber auch Aufnahmen aus dem Klinikalltag bedeutende Dokumente der Medizin- und Kulturgeschichte Österreichs darstellen.

Die Porträtsammlung umfasst zahlreiche Abbildungen bedeutender Mediziner:innen und sowie Wissenschaftler:innen aus angrenzenden Fachbereichen wie Chemie, Biologie und weiteren Naturwissenschaften. Neben Einzelporträts sind insbesondere Gruppenaufnahmen von Kongressen, Veranstaltungen sowie aus dem Arbeits- und Klinikalltag von besonderem Interesse. Ergänzend zum personenzentrierten Fokus enthält die Sammlung zwei umfangreiche Sammlungen an Fotografien und Drucken: ein großer Teil widmet sich dem Josephinum selbst, der andere dem Allgemeinen Krankenhaus sowie den Neuen Kliniken. 

Eine bedeutende Quelle für Fotografien und bildliche Darstellungen innerhalb der Sammlung des Josephinums stellen Nachlässe dar. Aus diesem Grund finden sich in der Porträtsammlung auch zahlreiche Aufnahmen, die nicht zwingend mit dem beruflichen Alltag der abgebildeten Personen in Zusammenhang stehen. Neben Reisefotografien sind auch private sowie familiäre Fotografien Teil der Sammlung.