Die Gemäldegalerie ist im Kern ein aristokratisches Sammlungsdenkmal, das auf das Legat von Anton Paula Graf Lamberg-Sprinzenstein im Jahre 1822 zurückgeht. Die Akademie verdankt diesem rund 700 Objekte umfassenden Legat unvergleichliche Schätze, allen voran das Weltgerichts-Triptychon von Hieronymus Bosch sowie zahlreiche Hauptwerke der flämischen und niederländischen Malerei, darunter das Bildnis einer jungen Frau von Rembrandt Harmensz. van Rijn, das Selbstbildnis von Anthonis van Dyck und Boreas entführt Oreithya von Peter Paul Rubens.

Erlesene Tafelbilder der italienischen Malerei am Übergang vom Mittelalter zur Renaissance, darunter die Marienkrönung von Antonio da Fabriano und Madonna mit Kind und Engeln von Botticelli gehen auf einzelne Schenkungen des Fürsten Johann II von und zu Liechtenstein zurück.

In den sogenannten Aufnahmewerken der Mitglieder der Akademie – wie Der Tod des Germanicus, 1789, von Heinrich Friedrich Füger – und den repräsentativen Porträts – wie das Bildnis Fürst Clemens Wenzel Lothar Metternich im Ornat eines Ritters des Ordens vom Goldenen Vlies von Johann Nepomuk Ender von 1835 – ist die Geschichte der Wiener Akademie dokumentiert. Das ikonische Bildnis Maria Theresias als Königin von Ungarn von Hofmaler Martin van Meytens zählt hingegen zum Altbestand und diente einst als Ausstattungsstück des Ratssaals der Wiener Akademie.

Das Kupferstichkabinett zählt zu den bedeutendsten grafischen Sammlungen in Österreich und dokumentiert als historische Lehrmittelsammlung das Geschehen an der Akademie. Aus seinen Beständen ist die gesamte Sammlung gotischer Baurisse auf Kulturpool vertreten, darunter der Aufriss des mittelalterlichen Wiener Rathauses von Laurenz Spenning. Dabei handelt es sich um ein einzigartiges Konvolut an Architekturzeichnungen aus dem Spätmittelalter, das Teil des UNESCO-Weltdokumentenerbes ist.

Zu den besonderen Highlights aus dem grafischen Bereich gehören auch Altmeisterzeichnungen der deutschen und niederländischen Schulen, wie das Bildnis eines achtzehnjährigen Jünglings von Albrecht Dürer und Zeichnungen von Rembrandt Harmensz. van Rijn, wie etwa die Landschaft mit Schenke und Bauernhäusern unter Bäumen.

Auch aus dem druckgrafischen Bereich sind zahlreiche Highlights auf Kulturpool zu finden, darunter die Melencolia von Albrecht Dürer oder das Hundertguldenblatt von Rembrandt Harmensz. van Rijn.

Die Glyptothek ist eine Sammlung historischer Gipsabgüsse, die als Lehrmittel für die Künstlerausbildung genutzt wurde. Sie umfasst heute noch 450 Objekte, die vorwiegend aus Abgüssen nach klassisch antiken Originalen, aber auch aus Hauptwerken der europäischen Skulpturengeschichte besteht.

Dazu zählen der Ares Borghese, die Kapitolinische Venus, die Medusa Rondanini, aber auch die Römische Pietà oder Der sterbende Sklave von Michelangelo, sowie Büsten von französischen Schriftstellern der Comédie Française. Besonders wertvoll sind die wenigen Originale – wie die Hera von Ephesos – und die Bozzetti aus der Ringstraßenzeit.